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本制品是百奥莱博供公司基于探针法荧光定量PCR技术开发的，专门用于水痘-带状疱疹病毒(VZV)研究检测的试剂盒。

水痘-带状疱疹病毒(Varicella-Zoster Virus，VZV)属人类疱疹病毒α亚科，又称人类疱疹病毒3型(Human Herpes VirusTyps 3，HHV-3)是水痘和带状疱疹的病原体，其基因组为线性双链DNA分子，长约124884bp。是一种儿童初次感染引起水痘，恢复后病毒潜伏在体内，少数病人在成人后病毒再发而引起带状疱疹的病毒。水痘是具有高度传染性的儿童常见疾病，多发于2～6岁，传染源主要是患者，患者急性期水痘内容物及呼吸道分泌物内均含有病毒。曾患过水痘的病人引起带状疱疹后，初期局部皮肤有异常感，搔痒、疼痛，进而出现红疹、疱疹，串连成带状，病程约3周左右，少数可达数月之久，还有可能出现脑脊髓炎和眼结膜炎等并发症。该病毒对人体健康有长期潜在危害，因此水痘-带状疱疹病毒的快速准确鉴定对该病的预防和检疫有着重要作用。

1. 即开即用，用户只需要提供样品DNA模板。
   
2. 引物和探针经过优化，分析灵敏性高，可以达到100拷贝/反应。
   
3. 提供阳性对照，便于区分假阴性样品。
   
4. 特异性高，引物是根据水痘-带状疱疹病毒DNA高度保守区设计，不会跟其他细菌的DNA发生交叉反应。
   
5. 涵盖性广，尤其是能检查危害人类健康的几种水痘-带状疱疹病毒。
   
6. 既可用于定性检测，又可用于定量检测。用于定量检测时线性范围至少为5个数量级。
   
7. 本制品足够50次20μL体系的探针法荧光定量PCR反应。
   
8. 本制品只能用于科研。

水痘-带状疱疹病毒qPCR引物-探针干粉在使用前需要短暂离心，然后在离心管中加入165μL的超纯水充分混匀后再使用，未用完的需要-20℃保存。

1. 标记6个离心管，分别为6、5、4、3、2、1。
   
2. 用带芯枪头分别加入45μL荧光PCR专用模板稀释液，最好用带芯枪头，下同。
   
3. 在6号管中加入5μL10⁷拷贝/μL的阳性对照，充分震荡1分钟，得10⁶拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
   
4. 换枪头，在5号管中加入5μL 10⁶拷贝/μL的阳性对照，充分震荡1分钟，得10⁵拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
   
5. 换枪头，在4号管中加入5μL 10⁵拷贝/μL的阳性对照，充分震荡1分钟，得10⁴拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
   
6. 重复上面的操作直到得到6个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。

7. 如果有N个样品，最好设置N+2个提取，多出的一个是PC(样品制备阳性对照)，一个是NC(样品制备阴性对照)。可以用10μL上步所得4号稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为PC。
   
8. 用自选方法纯化样品的DNA，本试剂盒跟市场上大多数样品DNA提取试剂盒兼容。也可以选购本公司的免提取核酸释放剂。

9. 如果做定量分析并且只做1次重复，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照(用水做模板)，6个用于标准曲线。如果做定性分析并且只做1次重复，则标记N+4个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照(用水做模板)，1个用于PCR阳性对照(直接用第6步第4号管的阳性对照稀释液做模板)。下面只以定量分析为例描述操作步骤。
   
10. 在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加)：
    

    成分	样品管 N+3个	RT-PCR 阴性对照	标曲样品管 (1-6)
    2×Probe qPCR MasterMix	各10μL	10μL	各10μL
    水痘-带状疱疹病毒qPCR引物-探针混合液	各3μL	3μL	各3μL
    待测样本DNA模板	7μL	－	－
    超纯水	－	7μL	－
    第6步所得标准曲线样品稀释液(1～6号)	－	－	各7μL

11. 盖上盖子后上机，按下面参数进行PCR：
    

    过程	温度	时间
    预变性	95℃	5min
    PCR反应 (37个循环)	95℃	15sec
    	60℃	1min(采集FAM通道，淬灭基团为TAMRA)

12. 如果样本制备阳性对照或PCR阳性对照(包括标曲样本)结果为阴性，则整个实验无效，不需要分析数据，需要重新样本制备，重新进行PCR扩增或跟厂家联系。如果样本制备阴性对照或PCR阴性对照结果为阳性，说明环境污染，则整个实验无效，不需要分析数据，需要跟厂家联系。
    
13. 如果阴性对照和阳性对照均正常，则实验有效，可以进入后续分析。
    
14. 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品DNA浓度的log值，再推算出其浓度。
    
15. 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照Ct必须等于或者大于35，或者没有Ct值。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于35。对待测样品，如果其Ct小于35则为阳性。如果在大于或等于35则为阴性。